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无菌技术操作标准1flv_Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV

更新时间:2021-03-02 00:55

通过非常简单的ELISA和流式细胞测定,在每一步都可以轻松监测与人类肝脏和免疫细胞的双重人性化小鼠模型。定期进行流式细胞测量,以评估功能免疫系统的发展,并观察艾滋病毒感染对免疫细胞的影响。在双人性小鼠中,功能免疫细胞的发育范围为淋巴细胞门的15%至90%。免疫细胞的代表性子集以点图显示(图3)。为了评估人类肝细胞的移植,ELISA每月在小鼠血清上执行人类特异性白蛋白水平。同时与HSP和HEP结合的小鼠在一个月内显示人类特异性白蛋白水平,从+7微克/mL到377微克/mL,在观察时间(6个月)继续增长(图4)。HIV感染对双human小鼠血液中人体免疫细胞的影响通过流动细胞测定和人特异性白蛋白ELISA监测肝脏中的HEP。ELISA评估,HIV-1在5周内导致血清中人类白蛋白水平下降,并且人类CK18-肝细胞在双人性小鼠的肝脏部分的消耗,如免疫组织化学评估(图5)。CD4:CD8的比例通常低于感染HIV小鼠的血液和肝脏,按流动细胞测定,与感染前同一小鼠的含量相比(图6)。材料表中讨论了对协议重要的所有试剂和材料。

Figure 1图 1:CD34+脐带血细胞富集的原理图。(A) 脐带血在淋巴细胞分离培养基(LSM)上分层,离心以分离布皮大衣。(B) LS 柱被放置在磁性支架上,然后用 BSA 缓冲液冲洗,然后添加浅色涂层。CD34的细胞阳性被夹在柱中,CD34-细胞在单独的管中洗脱。被困的CD34–柱树脂中的细胞用柱塞柱状柱塞柱状,细胞被收集到一个新的管中。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2图 2:人体化肝脏和免疫系统小鼠双重重组实验设计的原理图,其次是HIV-1感染。TK-NOG小鼠在-7日和第5天以6mg/kg的剂量注射甘西洛韦(GCV),每天2次,然后在第-3、-2和-1天注射硫丹。为了筛选小鼠进行移植 (Tx),在手术前一天进行丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 测定,并选择 ALT 水平为 >200 和 请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3图 3: 血液人体细胞分布的流式细胞分析门控策略。(A) 首先,淋巴细胞基于FSC-A和SSC-A全血封闭。(B) 单细胞在淋巴细胞上封闭。(C) 人类CD45+白细胞用小鼠CD45和人类CD45在单个细胞上封闭。(D) CD3+ T 细胞和 CD19+ B 细胞在门控 CD45+人白细胞上识别。(E) CD4+ T 帮助细胞和 CD8+细胞毒性 T 细胞在门控 CD3+ T 细胞中识别。(F) CD14=单核细胞从人类 CD45+白细胞门控。这里所呈现的结果来自一只用双人类肝细胞和HSPCs移植的小鼠。请点击这里查看这个数字的较大版本。

Figure 4图 4:白蛋白浓度由ELISA在双human小鼠的血清中测量。小鼠移植了人类肝细胞 (HEPs) 和 CD34–造血干细胞/祖细胞 (HSPCs) (n = 11)。在移植后1、4和6个月的不同时间收集血清,进行稀释以调整标准范围内的未知样品浓度。每个符号表示单独的鼠标值。结果表示中位数以及单个值。• P 等人8修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5图 5:对HIV-1对血清中白蛋白水平的影响和CK18+人肝细胞在双人性小鼠肝脏中的耗竭作用。(A) 在1个月和4个月时移植的带有人类HEP和HSPCs的未感染小鼠(n = 9)中监测白蛋白浓度。小鼠在移植后4-5个月感染HIV(n = 10),并在感染后5周内牺牲。每个符号表示单独的鼠标值。结果表示中位数以及单个值。• P 等人修改。8. (B) 未感染(HEPs + HSPCs,左面板)和HIV感染的TK-NOG小鼠(HEPs + HSPCs + HIV,右侧面板)的五微米肝部分是固定的,石蜡嵌入,并染色用于抗人细胞角蛋白-18(CK18)抗体。HIV-1导致CK18的耗竭——肝细胞由CK18人类细胞占用较少的区域证明。这里所呈现的结果来自一只未感染的小鼠和一只感染了HIV的小鼠,它们移植了双人肝细胞和HSPCs。比例条 = 100 μm。请点击此处查看这个数字的较大版本。

Figure 6图 6:CD4+细胞与CD8+外周血和双重组未感染小鼠和HIV-1感染小鼠肝脏中的T细胞的比例。对于双重组未感染小鼠:闭环;HEP = HSPC;血n = 7;肝脏n = 6。对于HIV-1感染小鼠:开放圆圈;HEPs = HSPCs = 艾滋病毒;血n = 10;肝脏n = 11。结果表示中位数以及单个值。• P 等人8修改。请点击此处查看此图的较大版本。